引物二聚體作為 PCR 的副產(chǎn)物，甚至有時(shí)候是主要產(chǎn)物充斥著我們的整個PCR 實(shí)驗(yàn)過程。引物二聚體其實(shí)就是一對引物或者引物自身的 3’ 端部分堿基互補(bǔ)結(jié)合，在 Taq 酶的作用下從 3’ 末端延伸所形成的小分子量的雙鏈 DNA 片段。
一、引物二聚體形成：
1）最根本的原因是引物之間或者引物自身 3’ 端部分堿基互補(bǔ)結(jié)合
2）模板量過低
3）引物濃度過大
4）引物長度過短
5）退火溫度低
6）循環(huán)次數(shù)過高
二、區(qū)分引物二聚體和目的條帶方法：
因?yàn)橐锒垠w的大小從幾十 bp 至幾百 bp 不等，所以當(dāng)你的目的條帶的分子量比較小的時(shí)候，電泳后所看到的結(jié)果不一定是目的條帶，很有可能是引物二聚體，所以我們需要一個有效的方法來區(qū)分二者。
當(dāng)我們對引物二聚體形成的本質(zhì)了解了之后，想要區(qū)分二者其實(shí)并不難，我相信大家看到這里的時(shí)候已經(jīng)知道了引物二聚體形成的本質(zhì)了，但是我還要強(qiáng)調(diào)一遍：引物二聚體形成的本質(zhì)其實(shí)就是引物之間或者引物自身的 3’ 端區(qū)域存在部分互補(bǔ)結(jié)合。
也就是說，引物的形成是不需要模板的參與的，所以我們只需要在電泳的時(shí)候添加一組對照就可以有效的判斷是否有引物二聚體的形成，以及如果有引物二聚體的形成，它的分子量是多大，從而區(qū)分開引物二聚體和目的產(chǎn)物。
這個對照就是：模板用 H2O 替代，其他的都一樣。這樣的話，如果這個泳道有條帶出現(xiàn)，那說明形成了引物二聚體（當(dāng)然前提就是該體系沒有被模板污染）。從這里也可以看出設(shè)置對照的重要性，一個巧妙的對照往往可以達(dá)到事半功倍的效果。
三、消除引物二聚體方法：
1、重新設(shè)計(jì)引物，這是解決該問題最根本的辦法
2、增加模板用量
3、減小引物濃度
4、引物長度適中
5、提高退火溫度
6、減少循環(huán)次數(shù)
7、可以適當(dāng)?shù)脑?nbsp;Mix 中添加少量的甘油或 DMSO
基本上消滅二聚體，最核心的注意：
1、3'尾巴的三個堿基最好不要全部是 G 或 C 組成的。
2、3'尾巴的三個堿基的互補(bǔ)序列不要出現(xiàn)在兩條引物序列里。
