ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。這種測(cè)定方法中有3種必要的試劑：1.固相的抗原或抗體；2.酶標(biāo)記的抗原或抗體；3.酶作用的底物。
根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀及檢測(cè)的具備條件，可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。
1.雙抗體夾心法測(cè)抗原
針對(duì)抗原分子上兩個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體。適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原，不適用于測(cè)定半抗原及小分子單價(jià)抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心。
2.競爭法測(cè)抗原
首先將特異性抗體包被于固相載體表面，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液，另一組只加酶標(biāo)記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色，這兩組底物降解量之差，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。此方法測(cè)定的抗原只要有一個(gè)結(jié)合部位即可，對(duì)小分子抗原如激素和藥物類的測(cè)定常用此法。優(yōu)點(diǎn)是快，缺點(diǎn)是需要較多量的酶標(biāo)記抗原。
3.免疫抑制法測(cè)抗原
被檢標(biāo)本對(duì)底物顯色的抑制程度與標(biāo)本中所含抗原的量成正比，二者之差即為預(yù)測(cè)抗原的量。
4.間接法測(cè)抗體
是檢測(cè)抗體最常用的方法，原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體。
本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標(biāo)抗體檢測(cè)各種與抗原相應(yīng)的抗體。主要用于對(duì)病原體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。
正式試驗(yàn)時(shí)，應(yīng)分別以陽性對(duì)照與陰性對(duì)照控制試驗(yàn)條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時(shí)本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血 清或BSA等封閉。
在ELISA中，進(jìn)行各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件的選擇是很重要的，其中包括:
1、 固相載體的選擇：
許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯yi 烯、聚苯y(tǒng)i 烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯y(tǒng)i 烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
2、包被抗體(或抗原)的選擇：
將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時(shí)，要求純度要好,吸附時(shí)一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時(shí)間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時(shí)。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進(jìn)行包被后，在其它試驗(yàn)條件相同時(shí)，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對(duì)于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。
3、 酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：
首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價(jià)的滴定(見酶標(biāo)記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。
4、 酶的底物及供氫體的選擇：
對(duì)供氫體的選擇要求是價(jià)廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時(shí)間后，應(yīng)加入強(qiáng)酸或強(qiáng)堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時(shí)間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。
