PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）是一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)，可用于擴增DNA序列。在PCR反應(yīng)中，引物是起關(guān)鍵作用的短鏈DNA分子，它們會與待擴增DNA序列的兩端匹配，指示聚合酶在這些位置開始復(fù)制DNA。
引物在PCR反應(yīng)中的作用為以下幾個方面：
1. 引物定義PCR擴增的目標序列： PCR擴增需要在待擴增DNA序列的兩端放置引物，引物的選擇和設(shè)計可以確保PCR擴增特定的DNA序列。引物的序列應(yīng)該能夠與待擴增DNA序列的兩端互補匹配，以便在PCR反應(yīng)中進行擴增。
2. 引物促進DNA序列的復(fù)制：
一旦引物與待擴增DNA序列的兩端匹配，聚合酶就會沿著DNA模板鏈復(fù)制新的DNA鏈。引物的序列決定了聚合酶的起始位置和方向。
3. 引物控制PCR反應(yīng)的特異性：
引物的選擇和設(shè)計可以控制PCR反應(yīng)的特異性，以避免非特異性擴增產(chǎn)物的形成。引物的長度、GC含量、Tm值等特性會影響引物的特異性。
4. 引物影響PCR反應(yīng)的效率：
引物濃度、長度、Tm值等因素也會影響PCR反應(yīng)的效率和產(chǎn)量。正確的引物濃度和設(shè)計可以確保PCR反應(yīng)的高效率和特異性。
PCR引物設(shè)計方法：
通常來說，引物的設(shè)計需要遵守一些基本的原則。這些原則很細，很多，也很繁瑣。但實際上對于常規(guī)的引物，并不需要考慮太多，達到實驗?zāi)康募纯?，更多的情況下需要靈活選擇。一般來說，引物設(shè)計需要遵循以下原則：
1. 引物的長度一般為15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38，因為過長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進行反應(yīng)。
2. 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯配。引物3’端出現(xiàn)3個以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，也會使錯誤引發(fā)機率增加。
3. 引物3’端的末位堿基對Taq酶的DNA合成效率有較大的影響。不同的末位堿基在錯配位置導(dǎo)致不同的擴增效率，末位堿基為A的錯配效率明顯高于其他3個堿基，因此應(yīng)當避免在引物的3’端使用堿基A。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。5’端序列對PCR影響不太大，因此常用來引進修飾位點或標記物。
4. 引物序列的GC含量一般為40-60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GC含量不能相差太大。
5. 引物所對應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。Tm值的計算有多種方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)。
6. ΔG值是指DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。應(yīng)當選用3’端ΔG值較低（絕對值不超過9），而5’端和中間ΔG值相對較高的引物。引物的3’端的ΔG值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。
7. 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（超過4.5kcal/mol）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進行。
8. 對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。
但是在實際設(shè)計過程中，往往很難同時滿足以上條件，因此只需要在設(shè)計引物時盡可能滿足即可，沒必要太過糾結(jié)。
同時需要注意，各種模板的引物設(shè)計難度不一，具體情況需要具體看待。有的模板本身GC含量偏高或偏低，導(dǎo)致找不到各種指標都十分合適的引物；在用作克隆目的的PCR因為產(chǎn)物序列相對固定，引物設(shè)計的選擇自由度較低。在這種情況只能退而求其次，盡量去滿足條件。
