細(xì)胞培養(yǎng)被支原體污染是個(gè)世界性問(wèn)題，在細(xì)胞培養(yǎng)中支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%。支原體是一類無(wú)細(xì)胞壁，形態(tài)呈高度多形性，為圓形、絲狀或梨形，其直徑僅有0.13～0.18μm，變形能力大，故能通過(guò)濾菌器，最突出的結(jié)構(gòu)特征是沒(méi)有細(xì)胞壁，對(duì)作用于細(xì)胞壁生物合成的抗生素不敏感。研究表明，支原體能耗盡營(yíng)養(yǎng)物，促進(jìn)代謝積累，導(dǎo)致pH改變，對(duì)細(xì)胞造成多種影響，包括生長(zhǎng)狀況、生化特性、代謝、免疫、以及細(xì)胞存活等多方面的改變，繼而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，或造成無(wú)法解釋的差異。更加不幸的是拯救被感染的細(xì)胞幾乎是不可能的。那如何檢測(cè)你的細(xì)胞是否收到支原體的入侵呢？下面介紹了幾種檢測(cè)方式，或許對(duì)你的實(shí)驗(yàn)有用。
1、分離培養(yǎng)法
分離培養(yǎng)法是支原體檢測(cè)的金標(biāo)方法，其檢測(cè)精確度最高。這種方法是從可疑的細(xì)胞培養(yǎng)體系中取樣，并接種到最適宜支原體生長(zhǎng)的瓊脂平板上。如果樣本中含有支原體，它們就會(huì)在這種瓊脂平板上瘋狂生長(zhǎng)，最終形成明顯可見(jiàn)的特征性菌落。分離培養(yǎng)法基本不會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果，因此被譽(yù)為支原體檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。
但是，分離培養(yǎng)法也存在兩個(gè)弊端，一是檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，支原體要長(zhǎng)出明顯克隆至少需要4周時(shí)間。二是盡管可以檢測(cè)絕大多數(shù)支原體種類，分離培養(yǎng)法也有力所不及的時(shí)候，例如支原體M. hyorhinis。
2、DNA檢測(cè)法，也稱直接培養(yǎng)法
將可疑樣品與指示細(xì)胞共同培養(yǎng)，一般需要幾天時(shí)間。DNA檢測(cè)所用的指示細(xì)胞通常是細(xì)胞質(zhì)區(qū)域較大的Vero細(xì)胞，如果原樣本中含有支原體，那么當(dāng)細(xì)胞DNA被熒光染料（如Hoechst染料）染色時(shí)，就可以在指示細(xì)胞的核周圍觀察到熒光斑點(diǎn)或熒光顆粒。
但是這種方法靈敏度太低，當(dāng)檢測(cè)成陽(yáng)性時(shí)，細(xì)胞經(jīng)常已經(jīng)嚴(yán)重污染。且Hoechst熒光染色：操作復(fù)雜，操作不當(dāng)易造成假陽(yáng)性或假陰性。
3、PCR法
市面上有許多商機(jī)提供基于PCR的支原體檢測(cè)試劑盒，如GeneCopoeia。這種方法已經(jīng)比較成熟，應(yīng)用的范圍也較為廣泛。
PCR法采用針對(duì)支原體DNA的引物用PCR檢測(cè)可疑樣本，其PCR引物可特異擴(kuò)增支原體基因組中rDNA保守序列，包括所有已知的支原體，及細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程普遍遇到的種屬，例如M. arginini、M. arthritidis、M. bovis、M. fermentans、M. genitalium、M. hominis、M. hyorhinis、M. neurolyticum、M. orale、M. pirum、M. pneumoniae、M. pulmonis、M. salivarium 和U. urealyticum。在凝膠電泳過(guò)程中，支原體DNA會(huì)顯示為特異性條帶，以此指示支原體的存在。
PCR法快速，簡(jiǎn)便，具有強(qiáng)擴(kuò)增能力和極高的敏感性，可以檢測(cè)大多數(shù)支原體，但謹(jǐn)慎起見(jiàn)最好同時(shí)使用另一種檢測(cè)方法來(lái)進(jìn)行驗(yàn)證。PCR法檢測(cè)支原體只需幾個(gè)小時(shí)，是最快但也是最不靈敏的支原體檢測(cè)方法。
4、酶學(xué)檢測(cè)
酶學(xué)檢測(cè)是將可疑樣本添加到特定底物中，在這一體系內(nèi)支原體的酶可以將ADP轉(zhuǎn)化為ATP，隨后能利用ATP發(fā)光的luciferase酶就可以指示支原體的存在。
最后，建議你進(jìn)行定期檢測(cè) 支原體感染會(huì)影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，因此對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞定期進(jìn)行支原體檢測(cè)非常重要。一般來(lái)說(shuō)每1至3個(gè)月就應(yīng)該進(jìn)行一次支原體檢測(cè)。將定期支原體檢測(cè)常規(guī)化堅(jiān)持下去，是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)支原體感染的關(guān)鍵。
通常來(lái)說(shuō)，被污染的細(xì)胞應(yīng)該丟棄，以避免成為污染源。但對(duì)于珍貴的細(xì)胞，以往別的品牌的支原體清除劑，其實(shí)只是抑制劑，它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成，但無(wú)法殺除。Mynox?是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌，可與支原體膜特異性結(jié)合，破壞膜通透性，導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。
支原體污染細(xì)胞后，有必要清除支原體，常用方法有：
1、對(duì)于非重要的細(xì)胞，如培養(yǎng)中的細(xì)胞、WCB的細(xì)胞等，將培養(yǎng)物與用過(guò)的培養(yǎng)基滅活后丟棄即可。對(duì)于較為重要的細(xì)胞，如來(lái)源珍貴或?qū)嶒?yàn)室中細(xì)胞保藏量較小等可以采用以下（2）-（8）的方法。
2、用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細(xì)胞，作用濃度為 25μg/ml，兩周可以清除支原體。
3、用清洗純化法清除支原體污染的方法：細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)馴化→優(yōu)質(zhì)細(xì)胞群的篩選→細(xì)胞清洗→反復(fù)離心洗滌，其原理是利用離心力、細(xì)胞、微生物質(zhì)量和懸液的浮力差達(dá)到清除支原體的目的。由于支原體個(gè)體小且除發(fā)酵支原體外多為細(xì)胞外寄生,所以通過(guò)反復(fù)洗滌細(xì)胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數(shù)量降低至ji 限. 如結(jié)合敏感抗生素的抑殺作用，可達(dá)到更好的效果。
4、藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí)，可殺死支原體，但對(duì)細(xì)胞有不良影響。
5、使用支原體特異性血清：用5%的兔支原體免疫血清可去除支原體污染，因特異抗體可抑制支原體生長(zhǎng)，故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性，并且5個(gè)月后仍為陰性。
6、動(dòng)物體內(nèi)接種除菌法：把受支原體污染的腫瘤細(xì)胞接種在同種動(dòng)物皮下或腹腔中，借動(dòng)物免疫系統(tǒng)消滅支原體，而腫瘤細(xì)胞卻能在體內(nèi)繼續(xù)生長(zhǎng)，待一定時(shí)間后，從體內(nèi)取出細(xì)胞再進(jìn)行培養(yǎng)繁殖。
7、巨噬細(xì)胞吞噬法：從動(dòng)物腹腔采取巨噬細(xì)胞，為排除其它細(xì)胞成分，可先進(jìn)行純化，然后再加入被支原體污染的細(xì)胞培養(yǎng)液中混合培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，為檢查支原體是否已被消除干凈，可利用支持物培養(yǎng)法驗(yàn)證，取出支持物逐日染色、鏡檢觀察，至支原體已被消除干凈為止。
8、使用支原體清除培養(yǎng)基，每2~3天更換1次新鮮培養(yǎng)液，換液時(shí)用無(wú)菌的平衡鹽溶液洗滌細(xì)胞1~2次；期間如果細(xì)胞密度過(guò)大，請(qǐng)保持細(xì)胞密度適當(dāng)（貼壁細(xì)胞可能需要用胰酶消化），并更換新的培養(yǎng)器皿，3天之后，即可見(jiàn)明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)支原體是否殺滅*；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細(xì)胞再次受到“支原體"的污染，以后每隔1個(gè)月進(jìn)行支原體的常規(guī)檢測(cè)，以保證沒(méi)有新的支原體污染。
注：支原體污染時(shí)細(xì)胞表現(xiàn)為長(zhǎng)得不好，也不死亡，同時(shí)，培養(yǎng)基又是清亮的，時(shí)間長(zhǎng)達(dá)一周也沒(méi)有什么變化，這時(shí)基本上可以判斷出是支原體污染了。
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