PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達納米級別。PCR驗室又叫基因擴增實驗室。
PCR技術(shù)原理：
DNA的半保留復(fù)制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈，在DNA聚合酶與啟動子的參與下，根據(jù)堿基互補配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。
在聚合酶鏈式反應(yīng)實驗中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時也可以發(fā)生變性解鏈，當溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，并設(shè)計引物做啟動子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。（ DNA高溫變性低溫復(fù)性）發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。
下面一起了解提高PCR反應(yīng)結(jié)果成功的參考技巧：
1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。
2、當酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動"開始循環(huán)時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。
3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。
4、對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預(yù)變性，后加模板進行正常PCR擴增。
5、沒有擴增產(chǎn)物：在提供MgCl2緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl2濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。
6、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl2，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg2+。
7、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。
8、檢查模板和引物的用量。
9、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。
10、泳道中出現(xiàn)模糊條帶： 減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。提高退火溫度，但不要超過68℃。 重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。
11、 建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。建議使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP組合的混合物。然而要得到最佳結(jié)果，優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。
12、基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴增片段至10kb。要擴增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻。降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴增的影響。
13、變性：第一步變性在94℃下進行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。
14、延伸：68--72℃下進行延伸操作。循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進行。測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。
15、引物設(shè)計： 一般長度20-30bp； 至少50%的GC含量；避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)； 引物對的Tm值應(yīng)該接近。
注意事項：
1、加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
2、使用干凈的塑料容器配置洗滌液。
3、按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。
4、底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
5、洗滌酶標板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應(yīng)孔中吸水。
6、使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器 。
7、實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。
8、試劑應(yīng)按標簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標準品應(yīng)丟棄，不可保存。
9、不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
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