用途
該試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿或其他相關(guān)生物液體中濃度。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗體包被于酶標(biāo)板上，實(shí)驗(yàn)時(shí)樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原會(huì)與包被抗體結(jié)合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。抗體與結(jié)合在包被抗體上的抗原結(jié)合、生物素與親和素特異性結(jié)合而形成免疫復(fù)合物，游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現(xiàn)藍(lán)色，加終止液后變成黃色。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測OD值，抗原濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中指標(biāo)的濃度。
| 反應(yīng)類型 | 夾心法 |
| 規(guī)格 | 96T |
| 反應(yīng)時(shí)間 | 4.5h |
| 反應(yīng)性 | 通用 |
| 檢測方法 | Colormetric |
| 靈敏度 | 檢測下線除以10 |
| 樣本體積 | 100μL |
| 樣本類型 | 血清、血漿或其他相關(guān)生物液體 |
| 特異性 | 可檢測樣本中的指標(biāo),且與其它相關(guān)蛋白無明顯交叉反應(yīng) |
| 重復(fù)性 | 板內(nèi)，板間變異系數(shù)均<10% |
樣品活化方法
生物樣品中的通常以無活性的形式存在，在檢測指標(biāo)活性前必須進(jìn)行活化處理。
活化方法如下：
血清、血漿： 280 μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液中加入40 μL樣品，混勻，加入40 μL活化試劑1，室溫孵育10分鐘。再加入40 μL活化試劑2，混勻后立即檢測。
注意：樣品被稀釋了10倍！
細(xì)胞培養(yǎng)上清：20 μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液中加入100 μL樣品，混勻，加入40 μL活化試劑1，室溫孵育10分鐘。再加入40 μL活化試劑2，混勻后立即檢測。
注意：樣品被稀釋了2倍！
組織勻漿：1960 μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液中加入40 μL樣品，混勻后檢測。
注意：樣品被稀釋了50倍！
精密度
板內(nèi)精密度:低濃度樣本,中濃度樣本和高濃度樣本分別在1塊板子上檢測20次。板間精密度:低濃度樣本,中濃度樣本和高濃度樣本分別在3塊板子上檢測20次。
| 批內(nèi)變異系數(shù) | 批間變異系數(shù) | |||||
| 樣本 | 1 | 2 | 3 | 1 | 2 | 3 |
| 數(shù)量 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 | 20 |
| 平均值( MERGEFIELD 單位ng/mL) | 0.41 | 1.07 | 4.96 | 0.47 | 1.25 | 4.24 |
| 標(biāo)準(zhǔn)差 | 0.02 | 0.05 | 0.22 | 0.03 | 0.06 | 0.2 |
| 變異系數(shù) (%) | 4.88 | 4.67 | 4.43 | 6.38 | 4.8 | 4.72 |
回收率
分別往5個(gè)不同樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍和平均回收率。
| 樣本類型 | 回收率范圍 (%) | 平均回收率 (%) |
| 血清(n=5) | 94-110 | 102 |
| 血漿(EDTA)(n=5) | 90-102 | 96 |
| 細(xì)胞上清(n=5) | 95-106 | 98 |
線性
分別往5個(gè)樣本中添加已知濃度的目標(biāo)蛋白，做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。將5個(gè)樣本分別稀釋2倍，4倍，8倍，16倍做回收實(shí)驗(yàn)，得出回收率范圍及平均回收率。
| 血清(n=5) | 血漿(EDTA)(n=5) | 細(xì)胞上清(n=5) | ||
| 1:2 | 回收率范圍(%) | 99-108 | 95-105 | 92-104 |
| 平均回收率(%) | 105 | 102 | 97 | |
| 1:4 | 回收率范圍(%) | 95-109 | 90-100 | 97-105 |
| 平均回收率(%) | 102 | 96 | 100 | |
| 1:8 | 回收率范圍(%) | 89-103 | 89-104 | 96-108 |
| 平均回收率(%) | 97 | 97 | 102 | |
| 1:16 | 回收率范圍(%) | 88-102 | 98-108 | 92-105 |
| 平均回收率(%) | 94 | 104 | 100 |
試劑盒組成及保存
未拆封的試劑盒可在4℃保存一周；如果一周以后才使用試劑盒，請(qǐng)拆開試劑盒按照下表中的條件分別保存各組分。
| 試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 |
| 說明書 | 1份 | 1份 |
| 封板膜 | 2片 | 2片 |
| 密封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) |
| 酶標(biāo)包被板 | 1×48 | 1×96 |
| 標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.3ml×6管 | 0.3ml×6管 |
| 酶標(biāo)試劑 | 5 ml×1瓶 | 10 ml×1瓶 |
| 樣品稀釋液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 顯色劑A液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 顯色劑B液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 終止液 | 3 ml×1瓶 | 6 ml×1瓶 |
| 20×濃縮洗滌液 | 15ml×1瓶 | 25ml×1瓶 |
| 試劑盒組成 | 48孔配置 | 96孔配置 |
| 說明書 | 1份 | 1份 |
| 封板膜 | 2片 | 2片 |
| 密封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) |
說明：所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發(fā)和微生物的污染。
試劑體積以實(shí)際發(fā)貨版說明書為準(zhǔn)。相關(guān)試劑在分裝時(shí)會(huì)比標(biāo)簽上標(biāo)明的體積稍多一些，請(qǐng)?jiān)谑褂脮r(shí)量取而非直接倒出。
操作步驟
1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；。
2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。
3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl，空白孔除外。
4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。
5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。
6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.
8. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。
9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。
試驗(yàn)所需自備物品
1. 酶標(biāo)儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10 μL, 2-20 μL, 20-200 μL, 200-1000 μL
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
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資料/datasheet
